概要” 

紧凑型毛细管电泳测序仪DS3000是将带负电荷的DNA分子注入到毛细管中，通过阳极与DNA溶液之间产生电位差的方式进行测定。此时，加载的电压（以下统称样品注入时电压）以及电压加载的时间（以下统称为样品注入的时间），对测定注入的DNA量或检测的峰值有很大的影响。因此，如果这些样品注入时的条件不正确，可能会导致数据的不准确。

DS3000中预先设定电泳分析模式，充分发挥仪器的优良性能，一般情况下不需要对每个样品检测进行条件检查。（对于信号强度极低的样品，建议更改样品加入条件，以保证得到理想的数据。）

我们设定了多种样品注入的条件，并确认了每个样品注入条件下的数据质量。在设定的样品注入条件下，可以检测出稀释100倍以上普通样品。

“结果” 

测序解析

Sequencing Analysis

用快速测序及标准测序,对Applied Biosystems™ 3500/3500xL Sequencing Standards, BigDye™ Terminator v3.1进行了分析。

此分析中将样品注入时电压设定为1.2 kV(初始值)，将样品注入时间设定为4(初始值) 、8、12、24秒。图1表示所获取信号强度与QV20CRL的相关性。此处，信号强度表示100-200 bp的全部峰的平均值。QV20CRL表示20 bp窗口中的平均QV值(碱基响应的可信度)超过99 %的最大碱基长度。由图1可知样品注入时间越长，信号强度越强。另外，碱基响应的可信度随着样品注入时间的延长而产生偏差。例如，样品注入时间为24秒的条件下,也有QV20CRL值小于300 bp的数据。

图1: 样品注入时间与信号强度以及QV20CRL的比较

Y轴(信号强度)表示100-200 bp的全部峰的平均信号强度。

X轴(QV20CRL)表示20 bp窗口中的平均QV值(碱基响应的信赖性)超过99 %的最大碱基长度。

相同倾向在比较每个碱基长度的错误率中也以得到验证(图２）。在样品注入时间为4秒（初始值）或8秒的条件下，所解析全部区域的错误率均不大于1%将样品注入时间延长到24秒时，长碱基侧的错误率也增大。由此可知，样品注入时，如果样品注入时间延长，可能会降低长碱基侧数据可信度，但是可以获取较强的信号。分析时，在未能获取所期待的信号强度等的情况下，可以用调整样品注入时间等方式充分地发挥仪器性能，但是请慎重考虑解析的区间。

图2: 样品注入时间与错误率的比较

以柱状图表示在各个条件下进行的72次试验中碱基响应的错误率。柱子宽度为20bp。

在柱状图可知，无论快速测序 (A)还是标准测序 (B)，长碱基侧的错误率将会随着样品注入时间的延长而增大。

其次，对于信号强度极低的样品，以调整样品注入时间的方式，确认信号强度的恢复情况。

用标准测序对稀释了100倍的Applied Biosystems™ 3500/3500xL BigDye™ Terminator v3.1Sequencing Standard进行了分析。

此分析中样品注入电压设定为1.2 KV(初始值)，样品注入时间设定为4秒(初始值)及24秒。其分析结果如图3所示。

在样品注入时间为4秒时，信号强度很低，在100-200 bp之间的平均信号强度只有19 RFU。并且，部分区间由于无法检测出峰，而频发读取错误(21个)。但是将样品注入时间延长到24秒时，平均信号强度恢复到125 RFU。而且读取错误也减少到两个。

图3: 以调整样品注入时间的方式恢复数据质量（测序）

图表表示，在样品注入时间为4秒（A）或24秒（B）时，100 bp附近的色谱与数据质量的比较（C）。并在40-700 bp的范围内验证了碱基的正误。

片段解析

Fragment Analysis

此分析使用了Promega® 公司生产的分子量内标(WEN ILS500)。此分析中样品注入电压设定为1.6 KV(初始值)或3.2 KV，样品注入时间设定为4、9秒(初始值)、18、27、36秒。

首先，绘制信号强度与分离性能（以下统称EQ）的比较图（图4）。EQ值是片段解析中表示数据品质的重要指标之一，表示识别一个碱基长度的不同位点范围的最大值。DS3000每次进行片段解析时会自动算出EQ值。样品注入电压为1.6 kV时，随着样品注入时间增长，EQ值保持不变，而信号强度将会增大。样品注入电压为3.2 kV时，在样品注入时间为4秒及9秒的条件下，与样品注入电压为1.6 kV时相比，可得到更大的信号强度与更高的EQ值。当样品注入时间大于9秒时，虽然可以获得更大的信号强度，但是 EQ值将会变低。

图4: 信号强度与EQ的比较

X轴（信号强度）表示分子量内标(WEN ILS500)的100 bp峰上所观测的信号强度。

以样品注入电压为1.6 kV、样品注入时间为9秒时所被观测的信号强度为基准而绘制相对信号强度。

Y轴（EQ）为在片段解析中的分离性能的指标。详细信息请参考本文内容。

其次，确认每个碱基长度的信号强度变化（图5）。样品注入电压为1.6 kV（初始值）时，在样品注入时间为4秒及9秒（初始值）的条件下，可以获得不依赖于碱基长度的相对信号强度。但是样品注入时间大于9秒时，短DNA的注入量多于长DNA的注入量。相同趋势在样品注入电压为3.2 kV的数据中更为明显。

综上所述，样品注入电压为1.6 kV时，信号强度与分离性能(EQ)不受样品注入时间的影响。样品注入电压为3.2 kV时，在样品注入时间为9秒或更小的条件下，可获取较强的信号强度与较高的分离性能。但是，样品注入时间大于9秒时，会发生EQ变低或根据碱基长度而产生信号强度的偏差等缺陷。对信号的定量性或片段大小的准确度有较高要求的测试应用需要特别注意。

图5: 样品注入条件与信号强度的比较

表示样品注入电压1.6 kV（A）及3.2 kV（B）的数据。

以样品注入电压为1.6 kV、电压施加时间为9秒时所被观测的信号强度为基准而绘制分子量内标各峰的相对信号强度。

最后，对于信号强度低的样品确认了用调整样品注入时间的方式，观察可以恢复信号的程度。用PowerPlex™ Fusion 6C System (Promega®公司生产)进行了样品调制。将试剂盒附带的质控DNA（2800M DNA）1 ng作为模板而作出扩增子，并且将该扩增子稀释了3000倍。样品注入电压设定为1.6 kV，样品注入时间设定为9秒及36秒。

使用Applied Biosystems™ GeneMapper ® 公司的ID-X ver. 1.6进行了等位基因识别。峰检测的阈值设定为50 RFU。结果如图6所示。样品注入时间为9秒时的信号强度较低，全部峰的平均信号强度为66.3 RFU。另外，一部分峰的信号强度小于检测阈值。但是样品注入时间增为36秒时，平均信号强度恢复为181.8 RFU。而且所被检测的等位基因全部与正确值一致。

图6：以调整样品注入时间的方式恢复数据品质（片段解析）

表示样品注入时间为9秒（A）或36秒（B）时的100 bp附近的电泳模式与数据品质的比较（C）。

平均信号强度表示分子量内标以外的全部扩增子峰的平均值。

所被检测的等位基因数表示在扩增子中与正确值一致的等位基因数。

结论

Conclusion

此报告中表示的是采用更改样品注入条件的方式调整信号强度与来改善数据质量的实例。由此实例可知，延长样品注入时间时，虽然可以获取较强的信号强度，但是分析性能有可能会降低。基于此特性，以调整样品注入电压与样品注入时间的方式，可以进行信号强度低的样品的解析。

实验条件

Experimental Conditions

测序解析

将3500/3500xL Sequencing Standards, BigDye™ Terminator v3.1溶解到300μL的Applied Biosystems™ Hi-Di™ formamide中。但是在图3的验证中， 用 Hi-Di™ formamide将溶液稀释了100倍。各个样品根据表1， 用DS3000进行了分析。

片段解析

用Hi-Di™ formamide将分子量内标（WEN Internal Lane Standard 500）稀释了20倍。但是在图6的验证中，使用了稀释400倍的溶液。根据附带的电泳分析模式调制了扩增子之后，用Hi-Di™ formamide，稀释了3000倍。各个样品根据表1， 用DS3000进行了分析。

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